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內(nèi)參GAPDH有兩條帶能用嗎（內(nèi)參兩個(gè)條帶）

發(fā)布時(shí)間：2023-04-13 20:15:41 稿源：創(chuàng)意嶺閱讀： 50

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本文目錄:

1、做定量pcr時(shí)內(nèi)參GAPDH變化了，是不是要換個(gè)內(nèi)參?
2、哪位知道GAPDH內(nèi)參有什么優(yōu)點(diǎn)？
3、內(nèi)參配制方法
4、gapdh什么情況下不用做內(nèi)參

內(nèi)參GAPDH有兩條帶能用嗎（內(nèi)參兩個(gè)條帶）

一、做定量pcr時(shí)內(nèi)參GAPDH變化了，是不是要換個(gè)內(nèi)參?

可以換一個(gè)。其實(shí)很多藥物影響糖代謝，會(huì)改變GAPDH。建議試試PPIA（肽基脯氨酸異構(gòu)酶），它與蛋白質(zhì)表達(dá)有關(guān)，含量比較穩(wěn)定，除靜息細(xì)胞外基本不變。

二、哪位知道GAPDH內(nèi)參有什么優(yōu)點(diǎn)？

◆Real－time PCR技術(shù)的原理就是用一種標(biāo)準(zhǔn)對照能夠估計(jì)出一種特異性靶DNA或RNA分子的相對含量。

◆這種標(biāo)準(zhǔn)對照就是參照物，在定量PCR中，用它來作為擴(kuò)增系統(tǒng)的陽性對照，并作為未知樣品定量的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)通過競爭性作用校正擴(kuò)增系統(tǒng)內(nèi)管間的擴(kuò)增效率，使其具有可比性。參照物按其性質(zhì)不同可分為內(nèi)參照和外參照。內(nèi)參照是與目的基因加于同一反應(yīng)管中，與目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，以反映體系中可能出現(xiàn)的PCR影響因素，此即所謂的競爭性PCR；而外參照則是參照物與目的基因的擴(kuò)增分別在不同的管間進(jìn)行，此即所謂的非競爭性PCR。

◆搞清了內(nèi)參和外參的概念，你的問題也就很容易解答了：由于你實(shí)驗(yàn)中GAPDH和目的基因反應(yīng)體系是在不同的EP管中進(jìn)行，所以它應(yīng)屬于外參照。

三、內(nèi)參配制方法

內(nèi)參配制方法：WB操作簡單，既可以定性分析表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)還可以指示目的蛋白量的相對變化。作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)是比較復(fù)雜的，因此用來測定表達(dá)產(chǎn)物時(shí)存在著一定的不確定性。所以，在WB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中加入良好的參照體系，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有幫助的。參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大?。?，空白載體對照（如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照），已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照，此外還有內(nèi)參。

內(nèi)參是zui容易被忽略的一項(xiàng)，如果要用WB比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對多少，等量的細(xì)胞上樣才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析，所以此時(shí)內(nèi)參就顯得尤為重要。

內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。在WB實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

蛋白濃度測定是比較各種樣品間上樣量的*方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法都存在局限性，不能*準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。

在WB中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個(gè)WB顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。

四、gapdh什么情況下不用做內(nèi)參

不恒定。GAPDH的基因表達(dá)量在是不同狀態(tài)下是變化很小的，所以可以認(rèn)為GAPDH表達(dá)是恒定的，能夠可以選擇它來做內(nèi)參，只有不恒定的情況下才不會(huì)選擇做，這樣會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)量會(huì)增多。

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