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qpcr數(shù)據(jù)造假會(huì)被看出來嗎（碩士畢業(yè)論文數(shù)據(jù)全是編的）

發(fā)布時(shí)間：2023-05-26 22:08:31 稿源：創(chuàng)意嶺閱讀： 141

大家好！今天讓創(chuàng)意嶺的小編來大家介紹下關(guān)于qpcr數(shù)據(jù)造假會(huì)被看出來嗎的問題，以下是小編對(duì)此問題的歸納整理，讓我們一起來看看吧。

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pcr平臺(tái)期不一致
如果一個(gè)基因沒有表達(dá)，realtimeqpcr會(huì)測(cè)出來嗎

qpcr數(shù)據(jù)造假會(huì)被看出來嗎（碩士畢業(yè)論文數(shù)據(jù)全是編的）

pcr平臺(tái)期不一致

技術(shù)文章
干貨分享|qPCR復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？
翌圣生物科技（上海）股份有限公>> 進(jìn)入商鋪
2020/10/17 9:51:48
干貨分享|qPCR復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？
王老師：您好，近用你們的試劑跑qPCR，復(fù)孔平臺(tái)期的熒光信號(hào)不同，這樣的結(jié)果能用嗎？
小翊：您好，老師。從圖中來看，復(fù)孔重復(fù)性是比較好的，△Ct值<0.5, 這個(gè)結(jié)果沒什么問題的。
王老師：那為什么復(fù)孔的平臺(tái)期信號(hào)還有相差呢？有什么方法可以使復(fù)孔熒光信號(hào)一致嗎？
近有不少客戶咨詢小翊類似的問題，擔(dān)心這樣的數(shù)據(jù)不可靠今天小翊就幫您解除疑慮！
復(fù)孔平臺(tái)期不同不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（△Ct<0.5）
*，理想的PCR擴(kuò)增是使DNA分子由1變2，2變4，以2n進(jìn)行擴(kuò)增的。但實(shí)際上，隨著循環(huán)數(shù)的增加，體系中的Taq酶、dNTP、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產(chǎn)物的生成，使得PCR不能呈指數(shù)擴(kuò)增，從而使實(shí)際的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“S”型，通常分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期三個(gè)階段，如圖1。
基線期是指PCR開始的3-15個(gè)循環(huán)時(shí)期，這段時(shí)期擴(kuò)增是存在的，但因循環(huán)次數(shù)較少，體系中雙鏈DNA積累較少，熒光信號(hào)強(qiáng)度沒有超過熒光本底信號(hào)，此時(shí)的熒光值對(duì)于機(jī)器來說很難準(zhǔn)確檢測(cè)。指數(shù)擴(kuò)增期是指PCR產(chǎn)物的量增長(zhǎng)//快的一個(gè)時(shí)期，理想條件下，是呈指數(shù)增長(zhǎng)的，在這個(gè)時(shí)期由于樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，所以復(fù)孔的熒光信號(hào)在這個(gè)時(shí)期相對(duì)一致。通常熒光閾值需要設(shè)置在此時(shí)期，熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱之為Ct值，故各復(fù)孔間的Ct值有較好的重復(fù)性（△Ct＜0.5）。而平臺(tái)期是指由于原料耗盡、反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生等原因使得擴(kuò)增變得緩慢的一個(gè)時(shí)期。此時(shí)期經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)較多，使樣品間的細(xì)小差異被無限放大，從而導(dǎo)致復(fù)孔間平臺(tái)期的熒光信號(hào)相差很大。
圖1 擴(kuò)增曲線的三個(gè)階段
下面為大家展示一個(gè)案例，以293T-cDNA的20倍稀釋液為模板，擴(kuò)增GAPDH基因，90個(gè)復(fù)孔（如圖2）。
圖2 同一樣品的90個(gè)重復(fù)的擴(kuò)增曲線圖
由圖可以看出該實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔重復(fù)性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE標(biāo)準(zhǔn)。但平臺(tái)期的熒光信號(hào)值均有差異。
綜上：數(shù)據(jù)的有效性和復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)關(guān)系不大，主要與復(fù)孔間的△Ct有關(guān)，MIQE標(biāo)準(zhǔn)是△Ct＜0.5。
在復(fù)孔△Ct<0.5的情況下，復(fù)孔平臺(tái)期不同并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是有沒有辦法可以讓復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)盡量一致呢？
使復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)趨于一致的秘訣
1、確保加樣的準(zhǔn)確性
1）qPCR各組分*化凍需要混勻。
2）采用預(yù)混的方式進(jìn)行加樣，保證體系的均一性。可以將除模板以外的試劑進(jìn)行預(yù)混，分注至各管中。
3）模板濃度高時(shí)，可將模板稀釋，提高加樣體積，減少加樣誤差。
2、確保移液的精///準(zhǔn)度
加樣過程需確保移液槍未出現(xiàn)漏氣、漏液的情況，避免使用精///準(zhǔn)度差的移液槍或者不配套的槍頭。
3、體系混勻并進(jìn)行離心
體系加完后要用移液槍吹打并進(jìn)行離心，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
4、qPCR試劑的選擇：選擇“預(yù)混液”形式的qPCR試劑，反應(yīng)體系只需加入引物和模板，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)的操作步驟，減少了加樣誤差。
好了，讀到這里，您應(yīng)該不會(huì)再用糾結(jié)復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同的事了吧？為了簡(jiǎn)化您的qPCR實(shí)驗(yàn)操作，讓您的qPCR數(shù)據(jù)更完美，小翊為您推薦一款SYBR Green預(yù)混液：Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat 11184ES），該產(chǎn)品是預(yù)混液形式的qPCR試劑，另外適合于所有的qPCR儀器平臺(tái)（如圖3），兼容快速程序，可以大大簡(jiǎn)化您的實(shí)驗(yàn)操作并能保證您實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。
圖3. 適合于所有的qPCR儀器平臺(tái)
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qpcr數(shù)據(jù)造假會(huì)被看出來嗎（碩士畢業(yè)論文數(shù)據(jù)全是編的）

如果一個(gè)基因沒有表達(dá)，realtimeqpcr會(huì)測(cè)出來嗎

　　如果一個(gè)基因沒有表達(dá)，realtimeqpcr會(huì)測(cè)出來
　　一般來講，進(jìn)行real-timeqPCRMasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-timeqPCR靈敏度高，所以每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗(yàn)值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個(gè)最佳反應(yīng)體系。
　　在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點(diǎn)需要注意：1.MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。2.的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。3.每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣！4.所有成分加完后，離心去除氣泡。5.每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔。參比或者校正染料（referencedye，passivedye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊(cè)商標(biāo)了！）或者其他染料，只要不影響檢測(cè)PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。
　　參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。通常來講，real-timeqPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候，進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。3.儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（platesetup）和程序設(shè)置（programsetup）。

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